陕西科技大学龚国利与张甜发明的粘细菌DNA质量提升基因组提取方法

陕西科技大学龚国利与张甜发明的粘细菌DNA质量提升基因组提取方法

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1。（10）申请公告（43）申请公告日期（21）申请号201410853181.2（22）申请日期2014.12.31C12N 15/10 15/10（2006.01）（71）Shaanxi科学与技术大学的申请人地址710021 Weiyang District，Shaanxi省大学公园1（72）发明家Gong Guoli Zhang Tian（74）专利机构XI'AN TONGDA专利公司有限公司61200特工Xu Wenquan（54）发明名称基因组，提取方法通过预处理提高阻塞性细菌DNA的质量（57）摘要一种基因组提取方法，可通过预处理提高粘液细菌的DNA质量。根据这种现象，粘液细菌在培养过程中会产生大量细胞外多糖粘液，因此细胞不易分散在液体中。在预处理过程中，添加到洗涤的粘性细菌中。

2。添加非离子表面活性剂，振荡超声波振荡器，然后添加SDS基因提取缓冲液和蛋白酶水浴以进一步混合液体中的表面活性剂以完全裂解细胞。这种方法是快速且易于操作的。所使用的试剂和实验仪器通常用于实验室，适用于一般实验操作。它们广泛适用于所有细菌的所有基因组DNA提取，具有较强的纯化能力，并且可以通过随后的PCR扩增来满足所获得的DNA。 ，DNA测序和其他操作。 （51）Int.Cl。（19）中华人民共和国国家知识产权办公室（12）发明专利申请要求2页和6页（10）申请出版物CN 104498478 A（43）申请出版日期2015.04。 08CN 104498478 A1/2 Page 21。

3。一种基因组提取方法，通过预处理提高粘性细菌的DNA质量，其特征在于以下步骤：1）预处理：在CNST培养基上培养粘性细菌5-7天，然后将细菌是身体转移到身体的离心管，用添加到离心管中的无菌水冲洗细菌，然后将非离子表面活性剂水溶液添加到细菌中，以使细菌均匀地分配。其中，非离子表面活性剂水溶液的体积每0.3-0.5g细菌为300-500L； 2）细胞裂解：将提取缓冲液和蛋白酶K溶液添加到摇动离心管中，然后以65-70加热，以使非离子表面活性剂分散均匀；其中添加到每0.3-0.5g细菌中的提取缓冲液体积为500-1000L；将蛋白质添加到每0.3-0.5g细菌中。

4。酶K溶液的体积为20-30L； 3）除去蛋白质：在步骤2中将氯仿和异糖醇的混合物添加到离心管中，均匀混合以获得乳液，然后离心以去除上清液；其中，氯仿和异氧氨基醇的混合物的体积为500-1000L每0.3-0.5g细菌； 4）DNA沉淀和洗涤：在步骤4的上清液中添加乙酸钠溶液和异丙醇。混合均匀后，进行离心，并且所获得的沉淀物是粗的DNA。在纯化粗萃取的DNA后，获得基因组DNA。 2。一种基因组提取方法，通过根据权利要求1进行预处理提高阻塞细菌DNA的质量，该方法在第1步中的特征是CNST培养基组件根据质量百分比计算得出，包括KNO30.05和NAH2PO40 .02。

5。5。MGSO47H2O0.1，FECL30.001，痕量元素溶液1ml/L，使用1mol/L KOH将pH值调整为7.2，琼脂粉15-20G/L，其余的是水，将其灭入121分钟30分钟;痕量元素解决方案包括MNCL24H2O 100 mg/L，Namoo42H2O，10 mg/L，Ki 20 mg/L，COCL220 mg/L，H3BO310 mg/L和EDTA 8 g/l。 3。一种基因组提取方法，用于通过根据权利要求1进行预处理提高阻塞细菌DNA的质量，特征在于第1步中的非离子表面活性剂是Tween 20，Tween 40，Tween 60，Tween 60，Tween 80或具有HLB值的蔗糖单酯10-16。 4。根据索赔。

6。3。一种通过预处理提高阻塞细菌DNA质量的基因组提取方法，其特征在于蔗糖单酯是蔗糖单酯S-1170或S-1570。 5。根据权利要求1或3。通过预处理改善粘性细菌DNA质量的一种基因组提取方法，其特征是非离子表面活性剂水溶液的质量浓度为0.3-0.5。 6。根据权利要求1的基因组提取方法，一种基因组提取方法，通过预处理提高粘性细菌的DNA质量，其特征在于步骤（1）中粘性细菌的细菌种类是纤维镜ATCC255532；步骤1）通过使用超声波振荡器来实现粘性，振荡时间为5-10分钟。 7。根据权利要求1的预处理改善粘性细菌DNA的质量。

7。基因组提取方法的特征在于第2步中，提取缓冲液包括pH为8.0、5-20 mmol/l的Tris-HCl，pH为8.0，2-20 mmol/l；质量为1-10的SD是水。提取缓冲液的体积添加到每0.3-0.5g细菌中为750L；步骤2）蛋白酶K溶液的浓度为20-30mg/L；步骤2）加热时间为0.5-1小时。 8。一种基因组提取方法，通过根据权利要求7进行预处理来提高粘性细菌DNA的质量，在第2步中所述的特征在于）提取缓冲液的pH值为8.0和10 mmol/l hcl，pH值为8.0，5毫米。

8。OL/L的EDTA，质量浓度为5的SD，平衡为水。 39。一种基因组提取方法，用于根据权利要求1提高氯仿和异糖醇的质量，其特征在于第3步中的氯仿和异糖醇在混合物中的氯仿与等异醇的体积比为24：1。 10。一种基因组提取方法，通过根据权利要求1进行预处理来提高阻塞细菌DNA的质量，在此中，步骤4）培养基中乙酸钠溶液的浓度为2-3mol/L，添加量为0.05-0.1倍上清液液体的体积；添加量的异丙醇量是上清液液体体积的0.6-1倍。步骤4）纯化是：用质量分数为70的乙醇溶液洗涤原油。

9。提取DNA，然后去除乙醇；步骤3和步骤4中离心的温度，速度和时间分别为4-10,000-14,000 g，分别为10-20分钟。权利要求CN 104498478 A1/6第4页4通过预处理技术领域改善粘性细菌DNA质量的基因组提取方法0001 0001本发明属于分子生物学领域，并与一种提取粘性细菌基因组DNA的方法有关通过预处理提高粘性细菌DNA质量的基因组提取方法。背景艺术0002粘菌病是一种革兰氏阴性芽孢杆菌，可以执行滑行运动。它主要在腐殖质，草食动物粪便，土壤和树皮组织中发现。它具有复杂的多细胞社会学行为，可以形成物种。丰富而多样的功能。

10。生物活性物质。尽管粘细菌是原核生物，但它们具有许多类似于真核生物的生理和生化特性，例如类似的细胞间传导模式，可以调节其运动和成果的身体产生。根据“底物类型的差异”，粘液细菌可以分为两类：细菌可溶性单群和纤维素可溶性分类单元。前者可以溶解酵母或其他真菌，细菌和其他微生物的完整活细胞，包括15属；后者不能降解活细菌（可以降解死细菌），但是只能以两个属（包括sorangium and byssophage）降解纤维素或半纤维素。粘液细菌的一个非常重要的特征是，它可以生产具有明显的生物学活性和结构特异性的天然产物，并且是各种代谢产物。除真菌和放线菌外，它是一种重要的微生物，可以产生丰富的二级代谢产物。资源。 0003。

11。sorangium cellularis（sorangium cellularisum）是“命令命令命令命令命令的命令”的命令命令的命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令命令的命令。命令的顺序命令的顺序命令的命令命令命令的命令命令命令的命令命令命令命令的命令命令命令命令命令的命令命令命令命令命令的命令命令命令命令命令的命令命令命令顺序的顺序命令的命令命令的命令命令命令的命令命令命令的命令命令命令命令的命令命令命令命令的命令命令命令命令命令命令的命令命令命令命令命令的命令命令并发症的顺序。雌酮是一种由纤维蛋白酶产生的大花环二级代谢产物。根据取代基发现了6种雌酮，即A，B，C，D，E，F，Ebomycin B和D具有明显的抗肿瘤活性。对于现在发现的粘性细菌，可以根据水果体和菌落作为主要基础的形态特征做出判断，并补充生理特征，但两者都有局限性。在反复转移和纯化后，许多粘性细菌的效果体很容易变形，甚至消失，使其分类状态难以确定。对于新物种，形态学的观察和分析更加不可靠。对于上述情况，必须使用分子。进行识别的手段。到目前为止，许多对粘性细菌的次要代谢已经存在。

12。尚未阐明产物表达的基因序列，因此没有有效的分子标记。粘性细菌的基因转化系统仍然不成熟，并且使用分子生物学手段有目的的粘性细菌转化的研究仍处于早期阶段。 0004由于在培养过程中，纤维纤维分泌大量细胞外酶降解周围的大分子，因此它依赖于细胞密度，并且细胞群产生的细胞外酶可以更有效地达到相对较高的浓度。 ，与此同时，它还可以减少扩散效应并使细胞互惠互利。此外，当纤维素生长时，它可以分泌大量细胞外多糖粘液，从而使细胞易于凝结且不容易分散，这不利于随后的分子操作，例如基因组DNA提取，基因组库，基因组库的结构和基因组库的结构和基因组库的结构和基因组库的结构和基因组库的结构，以及南部杂交。 。先前ART中一般基因组提取方法提取的粘性细菌的总DNA具有较低的纯度和DN。

13.提取A非常不稳定。本发明的发明的摘要是本发明的目的是解决先前艺术中的问题，并提供一种基因组提取方法，通过预处理来提高粘性细菌的DNA质量。该方法可以有效并快速提取粘性细菌的总DNA基因组，并高度纯化DNA基因组。 0006为了实现上述目标，本发明采用以下技术解决方案：规范CN 104498478 A2/6 Page 50007一种基因组提取方法，通过预处理提高粘性细菌DNA的质量，包括以下步骤：0008 1）预处理：将0009浓缩物粘性细菌在CNST培养基上培养5-7天，然后将细菌转移到离心管中，并用无菌水冲洗细菌至离心管，并将非离子表面活性剂添加到细菌中。代理的水溶液，摇动。

14。均匀分散细菌；在每0.3-0.5g细菌中添加非离子表面活性剂水溶液的体积为300-500L； 0010 2）细胞裂解：0011向振荡的离心管添加提取缓冲液。提取物缓冲液的体积为500-1000升，每0.3-0.5g细菌为500-1000L每0.3-0.5g细菌。蛋白酶K的溶液的体积为20-30L； 0012 3）去除蛋白质：0013在步骤2的离心管中加入氯仿和异己基醇的混合物，均匀混合以获得乳液，然后将其放在氯仿的混合物和异氧氨基醇的混合物上，是500-100-100-100每0.3-0.5 g细菌。

15，0L; 0014 4）DNA降水洗涤：0015在步骤4的上清液中添加乙酸钠溶液和异丙醇，混合均匀且离心机，并且获得的沉淀是粗萃取的DNA；纯化的粗萃取DNA纯化以获得基因组DNA。 0016在所述步骤1中，根据质量百分比计算CNST培养基组件，包括KNO30.05，NAH2PO40.025，MGSO47H2O 0.1，FECL30.001，TRACE ELEMER溶液1ML/L和1ML KOH和1ML KOH。 7.2。琼脂粉为15-20g/l，其余为水，将其灭菌121分30分钟；痕量元素解决方案包括MNCL24H2O 100mg/L，Namoo42H2O，10mg/L，Ki 20mg/L，Coc。

16。1220mg/l，H3BO310mg/L，EDTA 8G/L。 0017步骤1中的非离子表面活性剂为Tween 20，Tween 40，Tween 60，Tween 80或HLB值10-16的蔗糖单酯。 0018蔗糖单酯是蔗糖单链S-1170或S-1570。 0019非离子表面活性剂水溶液的质量浓度为0.3 -0.5。 0020步骤（1）中粘性细菌的细菌种为ATCC25532；步骤1）使用超声振荡器实现振荡，振荡时间为5-10分钟。 0021在步骤2）中，提取缓冲液包括pH值为8.0、5-20 mmol/l的TRIS-HCl，pH值为8.0，2-20 mmol/。

17。Lof Edta；质量浓度为1-10的SD，平衡是水；添加到每0.3-0.5g细菌中的提取缓冲液体积为750L；步骤2）蛋白酶K溶液的浓度为20-30mg /L；步骤2中的加热时间为0.5-1小时。 0022在所述步骤2中，提取缓冲液包括pH值为8.0和10 mmol/l的Tris-HCl，EDTA，pH为8.0和5 mmol/l，质量浓度为5，平衡为5 mmol/l，平衡为水。 0023氯仿和异己醇混合物中氯仿和异糖的体积比为24：1。 0024乙酸钠溶液在氯仿和异己醇的混合物中的浓度为2-3mol/l，添加的量是上清液体积的0.05-0.1倍。

18。异丙醇的量是上清液体积的0.6-1倍；步骤4）纯化是具体的：用质量分数为70的乙醇溶液清洗粗的DNA，然后去除乙醇；步骤3）和步骤4）离心的温度，速度和时间分别为4-10、10,000-14,000G和10-20分钟。规格CN 104498478 A3/6 Page 60025与先前的艺术相比，本发明具有有益的作用：0026 1。自从细胞破裂期间由多糖细菌分泌的多糖粘液粘液在多糖粘液中由多糖粘液粘液在粘液细胞中分泌这不利于DNA提取，本发明非离子表面活性剂用于治疗粘性细菌。非离子表面活性剂可以均匀地分散在水中，这可以有效地解决一个问题，即粘质细菌分泌的细胞外多糖粘液包裹细胞，并且细胞不能在液体中完全分离。

19。可以获得分散问题，因此可以获得整个基因组。此外，在随后的基因组提取过程中，添加的非离子表面活性剂溶解在有机溶剂中，例如氯仿，因此不会引起基因组中的残基，不会影响它。获得的DNA基因组的性能。本发明中获得的DNA的性能是稳定的，具有很高的纯度，并且产量可以特别是1-5 g/g。 0027 2。在本发明被非离子表面活性剂预处理后，将细胞用提取缓冲液和蛋白酶K溶液裂解。在提取缓冲液和蛋白酶K溶液的作用下，细胞以良好的裂解效果裂解，而DNA释放是完整的。这使得提取的DNA高度纯化。 0028 3。本发明的总体操作快速而简单。所使用的试剂和实验仪器是实验室中常用的仪器和试剂。它们适用于一般的实验操作，易于实现和放大生产。 0029 4。这项艺术。

20。它具有广泛的应用，可用于所有粘性细菌的基因组DNA提取。获得的DNA基因组具有很高的纯度，并且对随后的PCR扩增，DNA测序和其他操作感到满意。 0030进一步，非离子表面活性剂是HLB值10-16的蔗糖单酯，蔗糖单酯为：蔗糖酯S-1170（HLB值为11）或S-1570（HLB值为15）。由于蔗糖单酯可以溶于温水，因此可以在池的破裂阶段在水浴中的水浴加热期间完全分散。另外，蔗糖酯可以溶于氯仿和乙醇，在随后的DNA提取过程中易于去除，并且在弱酸和弱碱条件下稳定。因此，选择蔗糖单体以预处理内脏细菌可以完全分散细胞并提取整个基因组。本发明的详细说明0031本发明将与下面的特定示例有关。

21.解释，描述是对本发明而不是限制的解释。 0032本发明中使用的粘性细菌的应变为ATCC25532。在本发明中，CNST培养基组件以质量百分比计算，包括KNO30.05，NAH2PO40.025，MGSO47H2O 0.1，FECL30.001，跟踪元素解决方案1ML/L和1ML的pH值和1ML的pH值可将其调节至7.2 1mol/L KOH和琼脂粉15-20G/L，平衡为水，将121次灭菌30分钟；痕量元素解决方案包括MNCL24H2O 100mg/L，Namoo42H2O，10mg/L，Ki 20mg/L，COCL220MG/L，H3BO310MG/L，EDTA 8G/L。 SDS是十二烷基磺酸钠。在本发明中。

22. Tween 20，Tween 40，Tween 60，Tween 80山梨糖醇单肠酸盐含有聚乙烯氧化物损失的水。 0033示例10034 1）预处理0035在CNST培养基上培养粘性细菌，其中3-4块灭菌滤纸和1.5-2cm宽的灭菌滤纸7天，然后将0.3G细菌转移到Centrifuge中的2.0ml试管，在离心管中加入1.0毫升无菌水以冲洗细菌，以6000R/min的离心机持续5分钟，丢弃上清液并保留细菌；在细菌中加入300L蔗糖，质量浓度为0.3。单酯S-1570水溶液，然后用超声振荡器振荡5分钟，以均匀地分散细菌。其中，粘性细菌的应变为ATCC255320036 2）。

23.细胞裂解0037在摇动离心管中以20 mg/L的浓度加入500L DNA提取缓冲液和25L蛋白酶K溶液，并在65水浴中加热1小时。其中，提取缓冲液包括pH值为8.0和10 mmol/l的TRIS-HCL。手册CN 104498478 A4/6第7页； pH值为8.0和5 mmol/l的EDTA。质量浓度为5的SD，平衡为水。 0038 3）删除蛋白质0039在水浴下加热的离心管中加入500L氯仿和等异醇（氯仿的体积比和异氧氨基醇的体积比是氯仿和异氧氨基醇的混合物，是24：1），并混合了倒立的下均匀下均匀的状态。进入乳液，然后在10000 g时4分钟离心10 m。

24。在将上清液吸收到新的离心管中；重复此步骤2次以删除蔗糖单酯S-1570。 0040 4）DNA沉淀清洗0041将上清液的体积加到获得的上清液中的上清液2mol/L的0.1倍，乙酸钠溶液和上清液的体积的0.6倍，将上清液的体积倒置，然后以4或4或4或中心的速度中心。 10,000g持续10分钟，丢弃上清液，并提取原油DNA；使用750L用乙醇溶液清洗70乙醇溶液，质量分数为70，然后以4或10,000 g的速度离心10分钟，丢弃上清液，将其在烤箱中干燥80分钟，持续40分钟，然后完全蒸发乙醇以获得基因组DNA；所获得的基因组是DNA溶解在50升无菌水中，并以1 g/g的产量储存。 0042示例2004。

25，3 1）预处理0044在CNST培养基上培养粘性细菌，并用3-4块灭菌滤纸，用1.5-2厘米宽的灭菌滤纸培养5天，然后将0.4g细菌转移至管道中的2.0ml离心机，在管中离心。在离心管中加入1.0毫升无菌水以冲洗细菌，以6000R/min的离心机持续5分钟，丢弃上清液并保留细菌；将500升单体酯浓度为0.4添加到细菌中。用超声波振荡器振荡S-1570水溶液均匀分散细菌。 0045 2）细胞裂解0046将600L DNA提取缓冲液和28L蛋白酶K溶液以23 mg/L的浓度加入摇动离心管，然后在70水浴中加热50分钟。其中，提取缓冲区。

26。液体包括pH值为8.0和10 mmol/l的TRIS-HCL； EDTA，pH值为8.0和15 mmol/l；质量浓度为5的SD，平衡为水。 0047 3）删除蛋白质0048在水浴下加热的离心管中添加750L氯仿和等异醇（氯仿的体积比和异氧氨基醇的体积比在氯仿和异氧氨基醇的混合物中是24：1），并混合给倒倒。将其乳化，然后以4或12,000 g的速度离心10分钟，然后将上清液吸收到新的离心管中；并重复此步骤2次。 0049 4）DNA沉淀0050向获得的上清液中洗涤0050，加入3摩尔/L乙酸钠溶液，具有上清液体积的0.05倍，是异丙醇的体积的0.8倍，然后倒置。

27。拟合​​，然后在4或12,000克处离心10分钟，丢弃上清液，并获得粗dNA；用1000L乙醇溶液用质量分数为70，然后以4或12,000g离心4或12,000克10分钟，丢弃上清液，将其在烤箱中干燥90分钟40分钟以完全蒸发，以完全蒸发酒精并获得基因组DNA；产量为5g/g。将所得的基因组DNA溶于50升无菌水中并储存。 0051示例30052 1）预处理0053在CNST培养基上培养粘性细菌，该培养基的3-4块无菌滤纸，宽1.5-2厘米，宽6天，然后将0.5克细菌转移至2.0ml中，向中心管介绍1.0毫升无菌水到离心管。

28。洗细菌，以6000R/min的速度离心5分钟，丢弃上清液并保留细菌；在细菌中加入300升质量浓度为0.5的水溶液的300升水溶液，然后用超声波振荡器摇动8分钟。细菌均匀分散。 0054 2）细胞裂解指令CN 104498478 A5/6 Page 80055添加750L DNA提取缓冲液（pH值为8.0，15mmol/L tris-HCl； pH值为8.0，2mmol/L EDTA; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS; SDS;将浓度为20 mg/L的蛋白酶K溶液在68水浴中加热30分钟。 0056 3）卸下蛋白质0057，然后去水浴。

29。将1000升氯仿和异氧化物酒精添加到加热的离心管中（氯仿和异氧化物混合物中的氯仿和异氧氨基醇的体积比为24：1），将其倒置并混合到乳液中，然后将其混合成乳液，然后将其混合到乳液中，然后将其混合在一起在4或14000g处离心10分钟，并将上清液吸收到新的离心管中；重复此步骤2次。 0058 4）DNA降水洗涤0059加入2mol/L乙酸钠溶液和上清液等量等同的异丙醇在获得的上清液中，混合倒置，然后在14000g中混合10分钟，丢弃上清液，丢弃上清液，并获得高级摘录，并获得了粗糙的提取物DNA ;用1500L乙醇溶液用质量分数为70，然后以4或14000g的速率将其萃取的DNA洗涤10分钟，然后在烤箱中丢弃上清液和干100。

30. 20分钟以完全蒸发乙醇以获得基因组DNA；产量为3g/g。将所得的基因组DNA溶解在50升无菌水中。 0060在此示例中，Tween 80可以用Tween 20，Tween 40，Tween 60。然后将0.35克细菌转移到2.0毫升离心管中，将1.5毫升无菌水加到离心管以冲洗细菌，然后以6000R/min的离心值5分钟。 ，丢弃上清液并保留细菌；将400升蔗糖单酯S-1170加入细菌，质量为0.4。

31。然后使用超声波振荡器振荡5分钟，以均匀地分散细菌。 0064 2）细胞裂解0065添加1000L DNA提取缓冲液（20mmol/L tris-HCl，pH 8.0; 20mmol/L EDTA，pH 8.0；质量浓度7时SDS）和30 mg/l的浓度20升蛋白酶k溶液，蛋白酶k溶液，在65水浴中加热1小时。 0066 3）除去蛋白质0067在水浴下加热的离心管中加入600L氯仿和异糖醇混合物（氯仿和异氧氨基醇在氯仿和异糖醇中的体积比为24：1），并混合在一起。向下均匀地进入乳液，然后以10或10,000克的速度离心10分钟，并吸收上清液直至新鲜分离。

32。心中；重复此步骤2次。 0068 4）DNA降水洗涤0069将上清液的体积添加到获得的上清液中的0.08倍，以添加3摩尔/L的乙酸钠溶液和等体积的异丙醇与上清液相等，然后混合倒置，然后在4中混合。 10000g持续10分钟，丢弃上清液并获得粗萃取的DNA；用1500L的乙醇溶液用质量分数为70，然后以6000克离心20分钟，丢弃上清液。在烤箱中干100分钟，以完全蒸发乙醇以获得基因组DNA。将所得的基因组DNA溶于50升无菌水中。 0070示例50071 1）预处理0072将粘性细菌放在宽度为1.5-2 cm的灭菌滤纸纸3上。

将33。-4块CNST培养基培养6.5天，然后将0.45克细菌转移到2.0ml离心管中，在离心管中加入1.5毫升无菌水，以6000R/min min fifuge冲洗细菌10分钟，持续10分钟，持续丢弃上清液并保留细菌；添加500L质量指令CN 104498478 A6/6 Page 9蔗糖单酯S-1170的水溶液，浓度为0.3，并用超声波振荡器摇动5分钟。细菌均匀分散。 0073 2）细胞裂解0074添加900L DNA提取缓冲液（5mmol/L Tris-HCl，pH 8.0; 10mmol/L EDTA，pH 8.0;。

34。质量浓度为1），然后以27 mg/L的浓度加入22L蛋白酶K溶液，然后在70水浴中加热40分钟。 0075 3）删除蛋白质0076在水浴下加热的离心管中加入850L氯仿和异氧化物（氯仿的体积比和异氧氨基醇的体积比在氯仿和异氧氨基醇的混合物中为24：1），并混合给倒置下降。它具有乳液，然后以7或12,000 g的速度离心20分钟，小心地将上清液吸收到新的离心管中；重复此步骤2次。 0077 4）DNA降水洗涤0078添加2mol/L乙酸钠溶液，其体积是上清液的体积的0.1倍，是上清液的体积的0.8倍，将其倒置，然后将其混合在4。12000G的离心机中，以便于12000g的离心机。 10分钟。

35。丢弃上清液以获得粗dNA；用1000升乙醇溶液用质量分数为70，然后以10,12,000g离心20分钟，丢弃上清液，然后在室温下固定过夜，乙醇完全挥发以获得基因组DNA；将所得的DNA溶解在50升无菌水中。 0079为了解决粘液细菌分泌的多糖粘液使细胞聚集不利于DNA提取的问题，本发明使用非离子表面活性剂来预测粘液细菌以完全分散细胞，从而有效地溶解了细胞群的现象。其中，非离子表面活性剂使用HLB值为10-16的蔗糖单植物，例如蔗糖酯S-1170（HLB值为11），蔗糖酯S-1570（HLB值为15）。由于蔗糖单酯可以溶于温水，因此可以在池的破裂阶段在水浴中的水浴加热期间完全分散。另外，蔗糖酯可以溶于氯仿和乙醇，在随后的DNA提取过程中易于去除，并且在弱酸和弱碱条件下稳定。因此，选择蔗糖单体以预处理内脏细菌可以完全分散细胞并提取整个基因组。手册CN 104498478 A.