本发明涉及鲤鱼水肿病毒的检测方法和检测试剂盒。
背景艺术：
鲤鱼水肿病毒病（CEVD），也称为鲤鱼病毒睡眠疾病（VEC）或鲤鱼睡眠疾病（KSD），是对锦鲤和鲤鱼的新兴危害。繁殖的传染病。该疾病于1974年首次报道了日本锦鲤。后来被确定为痘病毒 - 鲤鱼水肿病毒（CEV）。随后是英国，荷兰，奥地利，德国，美国和其他国家。检测到该病毒，并显示出全球流行率的趋势。 CEV病毒表现出高死亡率，例如，健康的幼年KOI在感染CEV病毒后的死亡率高达80％。因此，对我国的病毒进行筛查对于确保重要的水产养殖品种（例如我国鲤鱼）的生产安全尤其重要。快速，有效，准确的检测方法是进行此类筛查和预防疾病的工作的先决条件。 。
目前，CEV病毒的检测方法很少，并且在中国没有报道。 CEV的主要临床症状是“睡觉”，g腐，凹形的眼睛，水肿等。嘴巴周围和鳍后部出血。这些症状包括其中许多症状，包括锦鲤疱疹病毒病（KHVD）。其他疾病非常相似。因此，很难根据临床症状判断鱼是否感染了CEV病毒。此外，没有关于CEV病毒与细胞的成功分离和培养的报道。国外已经基于嵌套的PCR和Taqman探针建立了荧光定量PCR，但这些方法具有其自身的缺点。例如，嵌套的PCR需要太长，一些学者报告说，这种方法容易产生非特异性条。测试结果受到严重影响，我们在实际的测试工作中也遇到了这个问题。荧光定量PCR对设备，检测环境和人员技能的需求极高，检测成本也很高，这极大地影响了这种方法的普及和使用。
技术实施元素：
为了解决上述问题，本发明首次建立了一种用于CEV病毒的单一常规PCR系统，该系统用于快速，准确地检测到在水产养殖过程中是否感染了CEV病毒并进行CEV病毒筛查和随后的预防疾病和控制系统。公司的建立提供了大力支持。本发明提供了一种用于检测鲤鱼水肿病毒的套件和方法。
首先，本发明提供了底漆对，如SEQ ID NO：1至2所示。
本发明还提供了Seq ID No：1至2中显示的引物对的使用，以制备药物来扩增或检测鲤鱼水肿病毒的基因。
本发明还提供了一个用于检测鲤鱼水肿病毒的套件，其中包括带有SEQ ID NO：1至2等序列的底漆对，以从鲤鱼水肿病毒中扩增基因。
本发明还提供了一种检测鲤鱼中水肿病毒的方法，包括以下步骤：
a，提取样品DNA：从样品中提取DNA；
B，基因扩增：使用权利要求1的试剂盒进行样品中的DNA放大；
c。结果检测：检测DNA扩增结果。
其中，步骤A中描述的样本是鱼体或水产养殖水体。优选地，鱼体是鱼体的ill组织。
本发明提供的试剂盒和方法可以特异性扩增鲤鱼水肿病毒的基因，而不会扩大其他鱼类病原细菌的基因片段，并且可以准确有效地检测是否已测试样品是否感染了腕水肿病毒。具有较强的特异性，可以有效地将鲤鱼水肿病毒与其他常见的水生病原体区分开，并且具有较高的灵敏度，短暂的时间和快速检测，可用于快速检测和预测鱼类疾病，防止发生鱼类疾病和发生。改善经济利益。
本发明将通过以下特定实施方案详细说明，但不是本发明的限制。根据本发明的上述内容，根据艺术中的普通技术知识和共同手段，而没有上述本发明的基本技术思想，也可以是各种其他形式的修改，替代或变化制成。
图纸的附加描述
图1引物PCR测试结果。
M：DNA标记II； 1：涉嫌CEV的鲤鱼的g组织； 2：空白控制。
图2具体检测结果。
M：DNA标记I； 1：空白控制； 1至9：8的组织，包括患病的鲤鱼的肝脏，脾脏，肾脏，眼睛，眼睛，大脑，肠和肠中含量； 10至12：1 CYHV-2，CYHV-3，草鲤鱼出血病毒； 13-17：阿拉蒂斯链球菌，海豚链球菌，类似shiga的邻居的单子纳斯，气瘤菌维克斯和邻苯二个气瘤； 18：积极对照。
图3灵敏度检测结果。
M：DNA标记I；重组质粒DNA用1至10：10次稀释的质粒DNA，1.5×101copies/μl至1.5×1010 copies/μl； 11：积极对照； 12：空白控制。
图4实际样品零件的PCR检测结果。
1：空白控制； 2、5、8、11：不同患病鱼类的ill组织； 3、6、9、12：不同患病鱼类的脾脏组织； 4、7、10、13：不同患病鱼类的肾脏组织； M：DNA标记II； 14：阳性对照
特定的实施方法
1。实验材料和仪器
1。病毒，细菌和鲤鱼样品
CYPES II型病毒（CYHV-2），CYHV-II型病毒（CYHV-3），草鲤鱼出血病毒，Alactis链球菌，链球菌海豚，Shiga-like Monomonas，Vickers cystella cystella cystella cystella and tongestella cystella and tongemonas hydophila均保留下来动物健康研究所，三个病毒是-80°C的DNA样品。涉嫌患有CEVD疾病的Cyprinus Parpio（即，“睡眠”的症状，g腐，凹面的眼睛等）是从Henan，Tianjin和Shenyang的鲤鱼种植池塘中收集的，并存储在-80℃。
2。主要试剂和仪器
基因组DNA提取套件是从Takara Company购买的； 2×PCR混合物购自Tiangen Company。主要仪器包括：组织研磨机（天根），常规PCR仪器（Bio-Rad），电泳仪器（Bio-Rad），凝胶成像系统（Bio-Rad），离心机（UKU Zhongjia），移液器（Eppendorf）（Eppendorf）
示例1底漆设计
1。实验方法
1。PCR引物设计和合成
选择Genebank数据库中包含的CEV病毒序列（序列登录号：KM283182.1，KX186571.1），并在这两个序列的保守区域中设计了一对PCR引物，并发送到上海Shenggong序列和产品。有关尺寸，请参见表1。
表1 PCR引物
2。细菌激活和模板制备
在实验之前，使用培养基激活阿拉克链球菌，海豚链球菌，类似志贺样的莫纳斯群岛，维多利亚气球和氢核酸菌，并使用基因组DNA提取试剂盒（Takara）进行DNA提取。有关特定的提取步骤，请参阅套件说明手册。
剖析了怀疑具有CEV的鲤鱼，依次采用g，脾脏，肾脏和其他组织，并用组织研磨机匀浆。 DNA提取还用于提取基因组DNA提取试剂盒（Takara）。有关特定的提取步骤，请参阅套件说明手册。
CYCA疱疹II型病毒（CYHV-2），CYHV-2型III型病毒（CYHV-3）和草鲤鱼出血病毒是实验中保存的DNA液，可直接用于PCR检测。
在无菌条件下，服用了5个怀疑有CEVD疾病的鲤鱼的g组织，将其混合为1个样品，并根据上述方法作为引物测试模板提取DNA。
3。PCR扩增和检测
总PCR反应系统为25μL，含有1×PCR混合物，0.3μmol/L引物F，0.3μmol/L引物R，2.5μL模板，并浇水至2.5μl。 PCR反应条件：在95°C下进行5分钟的预调查；然后38个周期（95°C变性15秒，退火60°C 20秒，延伸72°C 30秒），最后延伸72°C持续7分钟；该反应在4°C下终止。 PCR产物使用2％浓度琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳条件为200V和时间20分钟。
选择了通过PCR扩增确定为阳性的PCR产物，并选择了电泳检测并将其发送到上海Shenggong进行测序，并通过BLAST序列搜索并分析了测序结果。
2。结果
结果如图1所示，使用自主设计的引物来扩大与预期相同大小的PCR产物（图1）；此外，将PCR产物发送进行测序和爆炸搜索分析，结果表明，PCR产物序列仅如下：已发表的CEV病毒基因序列匹配高达100％的同源性。
测试结果表明，本发明的引物可以准确扩增鲤鱼水肿病毒的基因，并可用于鲤鱼水肿病毒。
示例2特定于引物的测定
1。测试方法
1。PCR引物
与示例1相同。
2。模板准备：
选择一个涉嫌患有CEVD疾病的鲤鱼，并在无菌条件下按顺序依次采用9个组织，例如肝脏，脾，肾脏，g，肌肉，眼睛，脑，肠，肠，肠，肠，肠，肠，肠和肠含量；同时，选择并准备3种常见的水生产产品。病毒和5种常见的水生细菌用作特定的测试病毒或菌株，即CYPSE疱疹II型病毒（CYHV-2），CYHV-2），CYPSE Herpes III型病毒（CYHV-3），草腕腕止出血性病毒，海藻链球菌，链球菌，Shigapoccus dolphoccus dolphinphin，shigaphinphin，shigaphinphin，dolphapoccus dolphapoccus dolphaphin，shigaphin dolphaphin，dolphaphin stretpoccus dolphapoccus dolphaphin，shigaphin dolphaphin，shigapoccus dolphaphin - 像邻居的单核细胞，气鼻虫和邻苯二核。根据实施例1的方法进行核酸提取和PCR检测模板制备。无菌水被用作空白对照，将阳性组织DNA用作阳性对照。
3。PCR扩增和检测
与示例1相同。
2。结果
结果如图2所示。对于患病的鲤鱼的九个组织，仅在g组织中检测到阳性，该组织与文献一致（Adamek M，Jung-Schroers V，Hellmann J等。由锦鲤昏昏欲疾病（KSD）[J] [J]的锦鲤组织中DNA的水肿病毒（CEV））疾病。通常是从ill中检测到的；此外，对于3种常见的水生病毒和5种常见的水生细菌，没有交叉反应。
该示例证明，本发明提供的检测方法是高度特异性的，可以准确地将鲤鱼水肿病毒与其他水生病原细菌区分开，并且可以准确地检测到是否感染了要测试的样品的鲤鱼水肿病毒。
示例3引物灵敏度测试
1。测试方法
1。PCR引物
与示例1相同。
2。模板准备：
选择了示例1中的PCR产物，该PCR产物被测序并验证为CEV病毒阳性，并发送到上海尚贡进行克隆，以制备含有PCR引物扩增靶序列的重组质粒。通过紫外分光光度计测量重组质粒的DNA浓度，并将拷贝数转化为1.5×1010拷贝/μl。重组质粒用作该实验的标准库存解决方案，并将梯度稀释10倍作为引物敏感性测试的模板。
3。PCR扩增和检测
与示例1相同。
2。结果
如图3所示，使用重组质粒以1.5×1010-1.5×101copies/μL作为模板测试了PCR系统的灵敏度。实验结果表明，该系统可以以最少1.5×102Copies/μL检测模板。
这个示例证明，本发明提供的鲤鱼水肿病毒的检测方法具有较高的灵敏度。
示例4组织样品检测
1。实验方法
1。PCR引物
与示例1相同。
2。模板准备：