本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种维氏气单胞菌减毒菌株的构建方法、菌株及其应用。
背景技术：
：韦德气单胞菌属于气单胞菌科气单胞菌属，是一种革兰氏阴性短细菌。它常见于淡水、污水、海水甚至土壤中。温托气单胞菌是一种高毒力的致病菌。致病过程主要包括在宿主体内粘附-侵袭-定植和毒素分泌。在此过程中，产生气溶素、肠毒素等一系列毒力因子。 ）和粘附因子等。这些毒力因子对水生动物、畜禽、甚至人类的感染起着决定性的作用。近年来，越来越多的病例表明，白癜风气单胞菌已成为人类和鱼类常见的重要致病菌。它分布广泛、致病性强，对食品安全起着决定性作用。一些国家已将其规定为食品安全检疫对象。目前，我们主要依靠抗菌药物来防治白癜风气单胞菌。然而药物预防方法直接导致耐药病原菌的形成，同时也造成药物残留、环境污染等诸多环境问题。现有研究表明，白癜风气单胞菌表现出多重耐药性。疫苗是有效预防白癜风气单胞菌的方法之一。减毒活疫苗具有保护力强、保护时间长、成本低、易于生产等优点。因此，降低维氏气单胞菌的毒力，构建维氏气单胞菌活性弱毒疫苗具有重要意义。技术实现要素：鉴于现有技术存在的技术问题，本发明提出一种维罗尼气单胞菌(Aeromonas veronii)，于2019年7月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏号为cctccno：m2019580。
一种维氏气单胞菌减毒株的构建方法，其特征在于，包括：采用基因工程技术手段对权利要求1所述的维氏气单胞菌DNA片段进行处理，使维氏气单胞菌exsa基因敲除、敲低或沉默。上述的构建方法，其中exsa基因的氨基酸序列如seqidno.2所示。如上所述的构建方法，其中exsa基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。根据上述构建方法，维氏气单胞菌属于气单胞菌属的凡氏气单胞菌种。根据上述构建方法，所述基因工程技术手段为同源重组技术。上述的构建方法，其中，所述同源重组技术为同源双交换。上述的构建方法，其中，所述同源重组技术为t-DNA插入、CRISPR/Cas9技术、talen技术、red/et重组技术中的任意一种。根据上述构建方法，所述基因工程技术手段为RNA干扰技术或锌指核酸酶基因打靶技术。根据上述任何构建方法构建的减毒白癜风气单胞菌。如上所述的维氏气单胞菌在制备针对维氏气单胞菌的减毒疫苗中的用途。本申请的焊接气单胞菌突变株毒力显着降低，达到了良好的减毒效果，为生产焊接焊接气单胞菌减毒活疫苗提供了可能。附图说明下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细说明，其中： 图1为携带敲除质粒pre112-δexsa的阳性转化子大肠杆菌wm3064的菌落PCR结果。根据本发明的一个实施例。鉴别;其中，m列代表dl5000的DNAmarker，m列左边代表相应条带所含核苷酸的数量；第 1 列代表维氏气单胞菌的野生型菌株；第2列代表携带敲除质粒pre112-δexsa wm3064阳性转化体的大肠杆菌。
图2为本发明一实施例的杂色气单胞菌exsa基因敲除菌株的菌落PCR验证；其中，m列代表dl5000的DNAmarker，m列左边代表相应条带所含核苷酸的数量；第1列和第2列代表使用维罗尼气单胞菌c4特异性引物a.veroniic4-f/a.veroniic4-r通过菌落PCR克隆获得的核苷酸数；第3列和第4列表示使用exs a 敲除验证引物exsa-f0/exsa-r0进行菌落PCR克隆获得的核苷酸数；第5、6栏表示使用pre112质粒特异性引物pre112-f-(2869)/p进行菌落PCR克隆re112-r-(3448)得到的核苷酸数；第 1、3、5 列使用与菌落 PCR 模板相同的菌落，第 2、4、6 列使用与菌落 PCR 模板相同的菌落。图3为本发明一实施例的杂色气单胞菌野生型(wt，以实心圆表示)和exsa敲除型(δexsa，以实心方块表示)的生长曲线；图4是根据本发明的。罗非鱼注射本发明一实施例的白癜风气单胞菌菌株后的累积死亡率统计；其中，图4a为本发明一实施例的白癜风气单胞菌野生型菌株注射后罗非鱼的死亡率。累积死亡率统计图4b为本发明一实施例注射维氏气单胞菌exsa敲除菌株后罗非鱼的累积死亡率统计。其中，实心点代表阳性对照，为罗非鱼注射液。注射水罗非鱼死亡率统计结果实心方块代表罗非鱼注射109cfu/ml浓度的exsa敲除菌株后罗非鱼死亡率的统计结果；实心三角形代表注射罗非鱼，注射浓度为108cfu/ml的exsa敲除菌株后罗非鱼死亡率统计结果；实心倒三角代表罗非鱼注射107cfu/ml浓度的exsa敲除菌株后罗非鱼死亡率的统计结果，图4a与图4b使用相同的参考数字；图5为本发明一实施例罗非鱼c4-δexsa攻击后相关酶活性的检测；其中，图5a为c4-δexsa攻击一周内碱性磷酸酶(akp)活性的变化；图5b显示了c4-δexsa攻击一周内超氧化物歧化酶(sod)活性的变化；其中，横坐标0表示不注射c4-δexsa期间罗非鱼的AKP和SOD活性。横坐标2、4和6分别代表注射c4-δexsa后2、4和6天罗非鱼的AKP和SOD活性。
具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明的。显然，所描述的实施例是本发明实施例的一部分，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在下面的详细描述中，参考了并入本申请并构成本申请的一部分的各种附图，示出了本申请的具体实施例。在附图中，相同的附图标记在不同的视图中通常描述相似的部件。下面对本申请的各个具体实施例进行详细地描述，以使本领域的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其他实施例，或者可以对本申请的实施例进行结构、逻辑或电学改变。基因：是指表达功能分子例如但不限于特定蛋白质的核酸片段，包括位于编码序列之前（5'非编码序列）和之后（3'非编码序列）的调控序列。 “天然基因”是指在自然界中存在时具有其自身调控序列的基因。 orf：开放阅读框，从起始密码子开始，是DNA序列中具有编码蛋白质潜力且不被终止密码子打断的碱基序列。突变基因：是通过人工干预而改变的基因。
这种突变基因的序列与相应的非突变基因的序列的不同之处在于含有至少一个核苷酸添加、缺失或取代。在本发明的某些实施方案中，突变基因包含由本文公开的同源交换引起的变化。突变的韦德气单胞菌是含有突变基因的韦德气单胞菌。本申请中的同源重组是指白癜风气单胞菌染色体上exsa基因两侧含有同源序列的DNA分子之间或内部发生重组，导致exsa基因被敲除或敲除。减少或沉默。重组DNA：指自然界中通常不会同时出现的核酸片段的组合。因此，重组DNA可含有源自不同来源的调节和编码序列，或源自相同来源但以不同于自然界中正常存在的方式排列的调节和编码序列。 cispr（成簇规则间隔短回文重复）/cas（crispr 相关）：是一种工程核酸酶系统，是一种可用于基因组工程的细菌系统，是许多细菌和古细菌适应性免疫反应的一部分。 Cas9：涉及Cas9基因，这是一种编码Cas蛋白的核酸内切酶，可以在DNA靶序列中引入双链断裂。它通常与侧翼的crispr基因座偶联、关联、或靠近或位于其附近。限制性核酸内切酶：一种在特定核苷酸序列处水解双链 DNA 的核酸内切酶。
ncoi 是一种限制性内切核酸酶，可特异性识别并切割序列 ccatgg。靶位点、靶序列、靶序列：在本文中可互换使用，指基因组（包括叶绿体和线粒体DNA）多核苷酸序列中被核酸内切酶基因特异性识别的序列。例如，ccatgg 是限制性内切酶 ncoi 的靶位点。转化：在本申请中，将质粒或外源基因转移到目标菌株的基因组中称为转化。涵盖可用于将核酸分子引入此类菌株的所有技术。 talen：转录激活因子样（tal）效应核酸酶、转录激活因子效应蛋白核酸酶。 Talen 是一种可以靶向并修饰特定 DNA 序列的酶。它使用 Tal 效应器（一种植物细菌分泌的天然蛋白质）来识别特定的 DNA 碱基对。 Tal 效应器可被设计为识别并结合所有感兴趣的 DNA 序列。 Talen 是通过将核酸酶附着到 tal 效应子上而产生的。 Tal效应核酸酶可以与DNA结合并在特定位点切割DNA链，从而引入新的遗传物质。 RNAi：RNA干扰技术。双链RNA对基因表达的阻断作用称为RNA干扰(RNAi)。双链RNA被酶消化后，会形成许多小片段，称为siRNA。一旦这些小片段与信使RNA（mRNA）中的相同片段相互作用，源序列的互补组合就会导致mRNA失去功能并降低蛋白质的表达水平，这意味着基因被“沉默”。
T-DNA：转移DNA，又称三螺旋DNA，是由三股ssdna旋转螺旋形成的特殊脱氧核糖核苷酸结构。 T-DNA是一段可以插入宿主细胞染色体的DNA。插入位置通常是随机的。 t-DNA 插入突变体是通过将一段 t-DNA 插入正常染色体而构建的。 Red/et重组技术：是由λ噬菌体红色操纵子（redα/redβ/redγ）和rac噬菌体rece/rect系统介导的DNA同源重组技术。锌指核酸酶基因打靶技术：是指在锌指核酸酶（zfn）驱动下，通过在靶基因中引入双链断裂再重组的一种基因修饰效率高的基因组编辑方法。锌指核酸酶基因打靶技术革兰氏阴性菌一般是指革兰氏染色呈红色或粉红色的细菌。相应的是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌的细胞壁比阳性菌的细胞壁薄。其细胞壁除含有与阳性菌相同的肽聚糖外，还含有脂多糖、核糖等。现有研究表明，革兰氏阴性菌的致病能力通常与其细胞壁的成分有关。 III型分泌系统（t3ss）存在于多种革兰氏阴性菌中，是由多组分蛋白复合物组成的跨膜通道。它在革兰氏阴性菌的鞭毛蛋白组装和胞外蛋白分泌等生理活动中发挥着重要作用。同时，它也是细菌分泌毒力因子进入宿主细胞的重要途径。例如，革兰氏阴性细菌利用它将毒力蛋白转运到真核细胞的细胞质中。
exsa 是一种革兰氏阴性细菌 arac 型 DNA 结合蛋白。它是一种arac型转录激活蛋白。它由约100个氨基酸的羧基末端结构域(exsa-ctd)和约170个氨基酸的氨基末端结构域(exsa-ntd)组成。作品。其中，exsa-ctd含有与t3ss相关启动子结合所需的两个螺旋-转角-螺旋结构，能够识别并与t3ss基因启动子区两个相邻的高度保守的共有序列结合，从而激活t3ss的表达。同时 exsa-ntd 介导同二聚化。 Exsa与其他三种Arac型DNA结合蛋白exsc、exsd和exse形成伴侣转换模型，共同调控T3SS的表达和分泌。 exsa是t3ss基因表达的主要激活剂，因此exsa可能通过影响t3ss来影响细菌毒力。维氏气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属。它是一种革兰氏阴性短细菌，不形成孢子，兼性厌氧，有鞭毛并且能运动。威尔士气单胞菌具有三型分泌系统（t3ss），其主要毒力因子包括外膜蛋白、气溶素、t3ss相关效应蛋白、鞭毛蛋白等。维氏气单胞菌是人类和鱼类常见的典型致病菌，是一种常见的致病菌。全世界水产养殖中常见的病原体。白癜风气单胞菌作为一种毒力极高的病原菌，可引起尼罗罗非鱼等多种鱼类发病，引起细菌性败血症、器官衰竭等症状，给水产养殖业造成巨大损失。
而且它对人类也是致病的。文献报道，这种细菌可引起人类菌血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等疾病。本申请涉及的白癜风气单胞菌经本实验室测序，于2019年7月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc），保藏号为cctccno：m2019580。本申请涉及的维氏气单胞菌(c4)均为该基因型的菌株。根据其野生型基因组序列分析可知，其exsa基因位于基因组DNA序列正链2009710-2010525区域，由共816 bp的核心苷组成。本申请利用DNA同源重组原理，敲除韦德气单胞菌基因组中的exsa基因，构建exsa突变株，以进一步检测exsa基因对韦德气单胞菌毒力的影响及其维持的可能性。气单胞菌exsa基因敲除株作为弱毒疫苗的应用.以下实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，除非另有说明，均可从商业来源获得。以下实施例中的定量测试均重复3次，结果取平均值。实施例1：利用同源双交换技术构建维氏气单胞菌exsa敲除菌株1、设计引物并扩增同源臂片段。在不影响exsa上下游基因编码的情况下，本申请选择含有exsa起始密码子有义链DNA序列为2009697-2010213、共516bp核苷酸的菌株作为敲除片段。
分别为其上游同源臂和下游同源臂设计引物exsa-f1/r1和exsa-f2/r2，并在引物中添加限制性内切酶bstxi酶切位点，在bstxi酶识别位点中间添加序列载体双酶消化所需的限制性内切酶 kpni 和 saci 的识别序列。其中，上游同源臂的DNA序列如seqidno.4所示，下游同源臂的DNA序列如seqidno.5所示。设计的引物如表1所示。提取威尔士气单胞菌c4野生型基因组DNA作为模板，使用引物exsa-f1/r1和exsa-f2/r2分别扩增上游和下游同源臂。表1 杂色气单胞菌exsa敲除菌株构建所需引物 引物名称 核酸序列 exsa-f1ctgcagaaccaggtacctggcacaccattaagtctgagtcexsa-r1ctgcagaaccagaattctgggaatctgcgtgtagt accagexsa-f2ctgcagaaccagaattctggccaggtcgagcggttgcaacexsa-r2ctgcagaaccagagctctggctgtgccgtgtcgggcacggexsa-f0ctgcttgtgactgtt gtaggexsa-r0gctatgccttgctcatcttga.veroniic4-fatggtcgcagagcttgtca.veroniic4-rcagcacaatagaacaccagacpre112-f-(2869)acatagccc cactgttcgtpre112-r-(3448)ttttcgtctcagccaatcc2。构建per112-δexsa敲除载体基因片段扩增：PCR，使用上述引物扩增上游同源臂片段（up-exsa）和下游同源臂片段（down-exsa）。
基因片段回收：使用PCR产物回收试剂盒分别回收扩增的上下游同源臂片段up-exsa和down-exsa。酶切：将回收的up-exsa、down-exsa和pre112质粒分别进行酶切。酶切时间和条件可根据所用限制性内切酶的不同性质而变化。例如37℃3小时，或4℃过夜等。酶切完成后，进行酶切回收。这里可以进行凝胶电泳回收，也可以直接进行回收。无论采用哪种回收方法，都可以使用直接从公司购买的套件来完成。连接转化：用连接酶将up-exsa和down-exsa同源臂片段分别连接到pre112质粒上。根据所使用的酶和连接方法的不同，连接条件也不同。该应用使用 T4 连接酶在 4°C 下连接过夜。连接完成后，转入大肠杆菌wm3064感受态细胞中。本申请中使用的转换方法是电转换。这里对转换方法没有限制。将转化的大肠杆菌铺在固体培养基（如lb培养基）上，并在37℃培养箱中培养过夜。菌落PCR：挑取单个菌落，使用引物exsa-f1/r2进行菌落PCR验证，与白癜风气单胞菌相应PCR产物比较，筛选阳性菌株。验证结果如图1所示。从验证结果可以看出，大肠杆菌wm3064阳性菌株经过菌落PCR后，可以获得一条大小约为540 bp的清晰条带（图2） ，并且可以从白癜风气单胞菌c4野生型菌株中获得一条大小约为1350 bp的清晰条带。结果符合预期。
培养阳性菌株，提取质粒并使用exsa-f1/r2引物进行测序。比对后测序结果与基因组序列一致，证明上下游同源臂已成功连接到pre112载体上。重组质粒命名为per112-δexsa。 3.构建exsa缺失突变株。以野生型威尔逊气单胞菌为受体菌株，以上述过程中获得的携带exsa敲除载体pre112-δexsa的大肠杆菌wm3064为供体菌株，进行接合转移实验。将pre112-δexsa转入杂色气单胞菌c4野生型，通过蔗糖压力筛选同源双交换菌株。挑选筛选后的单菌落，使用预先设计的敲除验证引物exsa-f0/exsa-r0和维罗尼库斯气单胞菌特异性引物a.veroniic4-f/a.veroniic4-r进行菌落PCR验证，得到两个阳性突变体菌株。敲除验证引物扩增的条带约为600 bp，分子量明显低于野生型菌株中的产物条带（约1100 bp）。特异性引物验证结果显示，验证的菌株均为白癜风气单胞菌。随后利用pre112载体特异性引物pre112-f-(2869)/pre112-r-(3448)对上述两株阳性菌株进行PCR验证。没有获得条带，证明外源pre112质粒已自发丢失（图2所示）。使用敲除验证引物exsa-f0/r0对两株阳性菌株进行PCR扩增。由于产生了非特异性条带，因此在送去测序之前对产物进行凝胶切割并回收。
测序结果与基因组序列比对证明exsa选定的敲除部分序列已被删除。敲除后δexsadna的序列如seqidno.3所示。上述一系列实验结果表明，通过敲除质粒pre112-δexsa介导的同源重组双交换，成功敲除威尔士气单胞菌c4基因组中的exsa基因，并将突变菌株命名为c4-δexsa。 。实施例2：韦氏气单胞菌exsa敲除型菌株的毒力检测1、生长曲线测量图3为韦氏气单胞菌c4野生型和exsa敲除型在相同条件下的生长曲线。如图所示，c4-δexsa与c4野生型在细菌生长速度、繁殖能力、对外界营养物质的感知和吸收等方面均无显着差异。说明exsa基因对白癜风气单胞菌的生长没有明显影响。 2、测试c4-δexsa对罗非鱼的半致死浓度（ld50），并对罗非鱼进行激发实验。本申请实验采用罗非鱼腹腔注射的方法来攻毒。将罗非鱼分为实验组和对照组，每组至少80尾。其中，实验组罗非鱼注射白癜风气单胞菌c4-δexsa，对照组罗非鱼注射等量白癜风气单胞菌c4野生型。首先，准备注射用菌液。将所需菌体（包括白癜风气单胞菌c4野生型和c4-δexsa突变体）加入灭菌的0.9%生理盐水或PBS缓冲液中，配置浓度分别为107cfu/ml、108cfu/ml和109cfu。 /ml 野生型和突变体注射菌株。
根据本发明的一个实施例，细菌细胞的量由细菌细胞悬液的od600值换算而来。例如，当威尔逊气单胞菌悬浮液的od600约为0.8-1时，1ml悬浮液中所含细菌的浓度约为2×108cfu。取所需量的悬浮液，离心以获得所需量的细菌。然后分别称量两组罗非鱼的总质量，并计算平均重量。按照10μl/g体重的注射量对罗非鱼进行腹腔注射攻击（例如：若罗非鱼的平均体重为10g，则每条鱼注射100μl菌液）。用于攻击的罗非鱼的重量为10g±1g。每个品系设置3个浓度梯度，每个梯度20条鱼。持续观察7天，记录累计死亡率。采用改良Kohl's法公式ld50=10xk-i(Σp-0.5)计算该菌株的半致死浓度(ld50)。其中xk是最大剂量的对数，p是每个浓度梯度的累积死亡率，i是两个相邻组之间的剂量对数之差。采用改良Couch法计算，韦德气单胞菌c4野生型的半致死浓度（ld50）为1.41×107cfu/ml（如图4a），韦德气单胞菌exsa敲除型的半致死浓度（ld50）为3.98×108cfu/ml（如图4b），毒性降低28.23倍与野生型。 3.攻击后罗非鱼相关酶活性检测。从以上实验结果可以看出，白癜风exsa敲除菌株对罗非鱼腹腔注射攻击的实验验证显示其毒力有所减弱。达到了预期的效果。
然而，如果动物疫苗要用于生产和开发，就必须确定一个使用浓度，使疫苗能够刺激机体的免疫活性，而又不会造成动物死亡。根据实验前查阅的文献，碱性磷酸酶（AKP）可以通过酶促反应去除革兰氏阴性菌毒力因子之一的LPS上的关键磷酸基团来进行解毒反应，并且常有文献将AKP视为一种鱼类攻击实验后检测到的重要免疫指标。超氧化物歧化酶（sod）可将细胞生命活动和细菌感染过程中产生的有害物质超氧阴离子自由基2o22-通过以下反应：2o22-+2h+→h2o2+o2转化为过氧化氢和氧气，同时过氧化氢会继续分解通过体内的过氧化氢酶（cat）和过氧化物酶（pod）转化成对身体完全无害的水。因此，sod对于人体初步抵抗细菌感染引起的氧化损伤具有重要作用。也有不少文献报道，草皮已成为鱼类攻击实验后检测到的重要免疫指标。因此，本申请选择碱性磷酸酶（akp）和超氧化物歧化酶（sod）进行攻击后检测。为了进一步验证敲除型威尔逊气单胞菌exsa作为减毒活疫苗的可能性，并找到可应用于后续实际生产的菌株浓度，本申请拟验证使用c4-δexsa不会杀死罗非鱼根本不。高浓度攻击罗非鱼后能否产生免疫力？
因此，选择焊接气单胞菌exsa敲除型半致死浓度（ld50）的1/5、1/25和1/125对罗非鱼进行腹腔注射激发实验。攻击用罗非鱼重量为10g±1g，每个浓度梯度40条。注射后发现，用ld50的1/5和1/25浓度攻击的两组罗非鱼在两天内死亡，而只有注射浓度为ld50的1/125的组没有死亡。任何死亡。因此，在攻击第0天选择罗非鱼，并在1/125ld50浓度攻击后2天、4天和6天进行解剖并获得内脏。按照超氧化物歧化酶（sod）活性检测试剂盒及组织和血液碱性磷酸酶（akp/alp）活性检测试剂盒说明书进行sod和akp活性检测。测试结果发现，APK活性在攻击后4天达到最大值，约为未攻击时活性的7-8倍，但在第6天下降，其活性与未攻击时基本相同。 SOD活性在病毒攻击后第二天达到最大值，约为未病毒攻击时活性的2-3倍。随后逐渐下降，攻击后第6天其活性与攻击前基本相同。以上实施例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。
技术领域：
本领域普通技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下做出各种改变和修改。因此，所有等同的技术方案也应当落入本发明公开的范围之内。 sequencelistingHainan UniversityConstruction method, strain and application of an attenuated strain of Aeromonas versonii hn02-cnap0075patentinversion3.31816dna Aeromonas vernii (aeromonas veronii) Aeromonas vernii (aeromonas veronii) Aeromonas vernii aer omonasveronii) 3CCAGGTCGAGCGGTTGCAACAGTTTATGAAAAAGCATTATCTGATGAGTGGAGTGGAGCTCAG60CGAATTCGCCAAAGAGTTCGGCGGCATGGCATGGGATGGACCCACTTCAAGGAGGAGGAGGAGCTGTTTTTTTTTTTTTTGGGCTCGATCGAT120A tatggtgtttcccagcgcgcctggatcagtgaaaggcggcggatccttttcgctcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcatcaattcaatagtcaatagtgaaatgaaatgagcatcgtcgatcgtcgattgcgatggcgcgcgcgcgcgcgcgcggcgcggcgcgccagcca240atcctattttacccca cccca ccca gagttatcgtcgtcgtttttttttgctgccagccaagccgtgccccgacgaca300cggcacagattaa31342334233nna aeromonas veronii 4cacaccataagtcattaagtctgtcggtcgttcgtgtgtgtggtggtggatgatgatgatgatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttaa GCTCTAATTTTTAGGC60TGGTTTTTTTTTTTTTTTGTGTGTGTGTGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCCCCCCCTCATTCATTTCAATGGTGATTGATTT120GAATTCACCAGCAGCAGCGAATGATGATGATCAAAAAAATAAATAAATAAATAAAATAAAAAAAATAAAAAATAAAATAACAACAATAATAAATAAATAAAAAAAA.ACAATAAAAA 180gcacccgagagcgacccgcttccggaggtgttatactggtactacacgcagattc2335308dna Aeromonas veronii (aeromonas veronii) 5ccaggtcgagcggttgcaacagtttatggaaaagcattatctgatggagt GGAAGCTCAG60CGAATTCGCCAAAGAGTTCGGCATGGGATGGACCCACTTCAAGGAGCTGTTGTTGTGTTGTCGTCGATCGAT120ATATGGTGTTGTTCCACGCGCGCGCCCTGGATGATCAGTCAGTGAAAGGGGCGGGCGGCTTCCTTTTTCGCTTCGCTCATCAATTCAATT180AT tactcaatagtgaaatgagcatcgtcgtcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcagcca240atcctatttttccccagttattatcgtcgtcgtttttttttttttttttttttttttcgccgccaagccaagccaagccgccgccgccgccgccgacccgaccagccagcagcagcagcggcagcggcaggcagcagcagcag300cggcacag300cggcacag308current