胭脂鱼养殖中运动型气单胞菌败血症与弯口吸虫病的防治研究
概括：
随着高密度养殖的发展，鱼病已成为制约该行业发展的重要因素。淡水鱼的运动性气单胞菌败血症（MAS）和斜口病（又称黄蛴螬病）分别是典型的鱼类细菌性疾病和繁殖病。福禄克病。鲻鱼（Myxocyprinus asiaticus）是我国特有的鱼类，为二级保护动物。同时，由于鲻鱼是亚洲唯一的下气孔科鱼类，因此它既具有重要的经济价值，又具有研究价值。近年来，上述两种病害在鲻鱼养殖过程中经常发生，给鱼苗培育和养殖生产造成很大损失。本研究重点对鲻鱼养殖场常见的上述两种疾病的病因、病理及免疫反应机制进行研究，以期深入分析宿主对MAS的免疫反应机制以及鲻鱼MAS的防治和斜线虫病。新的视角和参考。 1.鲻鱼活动性气单胞菌败血症的初步研究。为了对某养殖基地发生运动性气单胞菌败血症的鲻鱼幼鱼的病原菌进行鉴定，采用传统病原分离方法从病鲻鱼内脏和腹水中分离出病原菌。通过形态观察、生理生化特征分析、16S rRNA及cpn60、rpoB、gyrB基因序列分析及系统发育树构建等方法对细菌进行物种鉴定。通过返感染实验、半致死量（LD50）实验和16个毒力基因检测确定该菌株的致病性。同时进行32A药敏试验；为了获得鲻鱼活动性气单胞菌败血症的病理材料，选取健康鲻鱼幼鱼腹腔注射200 μL2。
0×10~8 cfu/mL(LD_(50-24h))嗜水气单胞菌菌液，并于感染后4、12、24小时采集中肾、头肾、脾脏、肝脏进行组织结构观察， 24 h取头肾、脾脏、肝脏进行超微结构观察，并采用评价不同时间点组织损伤程度半定量描述方法，以黑色素-巨噬细胞中心（MMC）为参考指标，采用定量分析方法描述各组织中MMC的反应策略，以评价组织免疫反应水平；为了探究许多病理现象背后的分子机制，对病原菌感染前后（4小时）的结果进行了分析。对鲻鱼的脾脏进行转录组分析，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测感染后4、12和24 h时19种免疫相关基因的表达量。主要研究结果和结论如下：（1）从自然产生的鲻鱼幼鱼内脏团和腹水中分离到2个优势菌株。通过生理生化特征和分子标记鉴定，确认两株菌株分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas Hydrophila）（命名为BBAh1）和维罗尼气单胞菌（命名为BBAv1）。 (2)再感染实验证实分离的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌为鲻鱼MAS的致病菌,并有7个毒力基因(aerA、alt、ascV、hlyA、lip、ompA和aspA)和8个毒力基因(aerA、alt、ascV) 、hlyA、lip、aexT、ast 和 flA)，7 天半致死剂量两者对鲻鱼幼鱼的(LD_(50-7d))分别为1。
93×10~5 cfu/g和8.77×10~5 cfu/g；而嗜水气单胞菌致死率更高，白癜风气单胞菌引起肠炎的比例更高。 (3)对32种药物的药敏实验结果表明，两株菌株具有相似的药敏特性，对28种药物表现出相似的敏感性。这可能与两种菌株起源于同一环境有关；建议使用两种对头孢噻肟、氨曲南、头孢曲松、头孢呋辛等药物非常敏感的菌株来治疗鲻鱼运动性气单胞菌败血症。 (4)MAS的组织微观结构和病理特征为：内皮细胞损伤、溶血、凝血、MMC反应、组织坏死、淋巴细胞浸润、嗜酸性粒细胞胞质增强、肝细胞空泡化、凝固样坏死。以及细胞质嗜酸性变性和红细胞萎缩变性等；超微病理特征为：肾小球毛细血管塌陷，系膜细胞肿胀，足细胞增生，滤过装置严重破坏。巨噬细胞功能活跃，表现出大量吞噬各种受损细胞，包括淋巴细胞和嗜酸性粒细胞；肝病时，间质严重受损，肝细胞内糖原消失，线粒体外凸肿胀，自噬溶酶体增多。上述现象表明，鲻鱼MAS引起组织严重病理变化，进而导致机体造血、排泄和代谢功能障碍，是细菌感染和死亡的主要原因。 (5)MAS发生过程中组织MMC反应策略：中肾、头肾、脾脏的MMC反应策略基本相同，表现为单个MMC的面积和数量越来越大，相对组织面积越来越大；肝脏的MMC反应策略与上述组织不同。即感染后12小时内，肝脏内MMC指标基本没有变化。直到感染后第24小时，组织中MMC的数量和相对组织面积才显着增加（P0.05）。
05）。 (6)组织MMC应答策略反映了组织器官的免疫应答策略，即脾脏在细菌感染引起的免疫应答中占据主导地位，其次是头肾、中肾，免疫最弱的肝脏反应能力；另外，由于脾脏的MMC反应最为敏感，因此更适合作为评价机体生理状态或免疫水平的生物指标。 (7)急性感染嗜水气单胞菌4 h后，鲻鱼脾脏中共获得显着差异表达基因1390个(q0.05)，其中显着上调907个，显着下调483个。 ;随机选取8个差异基因表达的基因进行qRT-PCR验证，发现qRT-PCR结果与转录组结果的表达趋势基本一致，从而证明了转录组数据的可靠性。 （8）1390个差异表达基因显着富集在16个二级GO类别中，主要是白细胞介素1受体结合（GO：0005149）、白细胞介素1受体复合物（GO：0045323）、细胞因子受体结合（GO：0005126）、炎症反应（GO） :0006954)、生长因子受体结合 (GO:0070851) 和免疫反应（GO：00 06955）等； 15条KEGG信号通路，主要包括：NF-kB信号通路（ko04064）、TNF信号通路（ko04668）、NOD样受体信号通路（ko04621）、Toll样受体信号通路（ko04620）和炎症性肠炎疾病IBD（ko05321） ）， ETC。;上述GO类别和信号通路均与机体的免疫反应有关。
(9) qRT-PCR检测结果显示：模式识别受体（TLR2、TLR4、TLR6和PGRP5）、白细胞介素（IL1B、IL6、IL8、IL10、IL11和IL12）、趋化因子（CXC L1、CXCL2和CXCL8）、免疫细胞活性调节分子（CD68、CD200、CD247、CSF3 和 CSF3R）和补体（C6和C7）和许多其他免疫相关分子积极参与人体的抗菌活性。 （10）根据转录组和qRT-PCR结果推测，鲻鱼对嗜水气单胞菌感染的免疫应答机制可能为：病原体进入体内后，其病原体相关分子模式（PAMP）为被模式识别受体（例如 TLR）识别。和PGRP5），那么接收到信号的受体细胞开始分泌细胞因子，如IL1和TNF等，这些细胞因子反过来激活MAPK信号通路，而MAPK信号通路的激活将直接启动激活其下游的NF -kB 信号通路反应。激活的 NF-kB 进入细胞核并与靶基因上游的特定序列结合以启动转录。此时，身体开始启动强烈的免疫反应，以抵抗病原菌的进一步感染。这可以在组织学水平上看出。免疫细胞大量增殖、吞噬作用活跃、MMC反应强烈、炎症细胞浸润组织等。但与此同时，MAPK和NF-kB信号通路似乎激活了一种负向调节机制，以避免机体过度炎症反应。身体。 2.鲻鱼弯曲口虫病的初步研究。本研究从天然人工池塘中随机抽取148条鲻鱼幼鱼进行编号并测量生长指标（全长、体长和体重）；然后，通过解剖去除鱼组织。剥去寄生虫包囊，记录包囊的位置和数量，计算感染率、感染强度、局部感染率和局部感染率。染色强度；用解剖针分离包囊内的包蚴并保存在70%酒精中，然后利用形态学（包蚴标本的制备）结合分子生物学方法（CO1和ITS）来鉴定包蚴种类；对于复杂吸虫G.吸虫生命周期的第一个中间宿主是淡水蜗牛，最终宿主是食鱼鸟类。在患病的鲻鱼养殖场调查了寄生虫的生活史。
主要研究结果和结论如下：（1）囊蚴形态和分子标记鉴定结果证实本研究分离的寄生虫为Clinostomum complanatum。这是鲻鱼甚至底口鱼作为扁口虫中间宿主的首次记录，证实了囊蚴生殖系统的形态特征是鉴定该类寄生虫的可靠形态学依据。 CO1（6.87%）比ITS（1.68%）具有更高的突变位点率，识别弯曲口虫的效率更高。 (2)随机检验样品中共有96尾鲻鱼感染扁平口虫，感染率为64.9%，感染强度为1～7(2.3±1.38)个囊蚴/尾；与躯干和尾部相比，鲻鱼头部囊蚴分布较多，相应的局部感染率和局部感染强度分别为0.557和0.545。 (3)感染组与未感染组全长、体长差异均无统计学意义(P<0。05)。在体重和丰满度方面，感染组（体重=6.44±0.19 g；丰满度=1.70±0.03 g/cm~3）显着低于未感染组（体重=10.36±0.51 g；丰满度=1.70±0.03 g/cm~3）。 =2.51±0.03g/cm~3)(P0.01)。 （4）受感染渔场的扁口吸虫生活史完整：黑头鱼、鲻鱼为第一中间宿主，鲻幼鱼为第二中间宿主，食鱼鸟白鹭为第二中间宿主。白鹭 (Egretta garzetta)、池鹭 (Ardeola bacchus) 和普通翠鸟 (Alcedo bengalensis) 是终端宿主。
（五）防治建议：1）年底彻底清塘并用生石灰灭螺，清除池塘导流渠道内繁殖的寄主螺； 2）鱼苗、鱼种养殖池上方设置防鸟网。综上所述，上述研究表明，首次从患有运动性气单胞菌败血症的鲻鱼中同时分离到高致病性嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌，并根据药敏试验结果筛选出合适的分离株。治疗鱼类活动性气单胞菌败血症的药物；通过观察幼鲻鱼急性感染嗜水气单胞菌前后肾脏、脾脏和肝脏的微观和超微结构变化，发现了一系列未报道的运动性气单胞菌败血症。单位细胞细菌性败血症的病理现象，以及组织中黑色素巨噬细胞的中枢反应；通过对嗜水气单胞菌刺激的鲻鱼脾脏进行转录组分析，并通过qRT-PCR检测感染前后免疫相关基因的表达情况，发现以TLRs和PGRP5为代表的PRRs在早期病原体识别中发挥重要作用。此步骤是激活其下游信号通路并产生免疫反应的关键。这项研究还发现，鲻鱼甚至底口鱼是扁口目动物的中间宿主；明确了患病渔场扁口虫的完整生活史；并提出清塘灭螺、防鸟等防治措施。
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