新型生物固氮方法：自生固氮细菌在含氮废水中的高效应用

新型生物固氮方法：自生固氮细菌在含氮废水中的高效应用

介绍

人工固氮对于维持全球 77 亿人的生存至关重要，人们长期以来一直致力于寻找更便宜、更环保的哈伯博世固氮工艺替代品。在这项研究中，作者通过在含氮废水的反应器中富集自生固氮细菌（NFB），开发了一种新的生物固氮方法。

该反应器以每天每升11.8毫克氮的速度固定了大量的氮，这一速度接近最近的“突破性”固氮技术，并且远高于在低碳氮比反应器中观察到的速度。 qPCR 用于定量 nifH（用于识别固氮微生物的功能基因）和 16srRNA 基因。 nifH基因在固氮反应器中富集了10倍，达到细菌总数的13%。 16S rRNA基因扩增子序列分析显示，巴氏梭菌在微生物群落中占主导地位（19%）。

作者设想这些富含氮的生物有可能被用作生物肥料，并且处理后的废水可以通过相对简单的后处理过程排放到环境中，进一步减少对环境的危害。

论文编号

翻译名称：含氮废水处理系统中固氮菌的富集

通讯作者: 卡罗莱纳·奥斯皮纳-贝坦库斯

通讯作者单位：英国纽卡斯尔大学

图文摘要

实验设计

接种物：用来自四个不同地点的40ml污泥接种反应器并以相同比例混合。第一个样品取自工业和生活废水处理厂（BS），第二个和第三个样品取自造纸厂废水处理厂，第四个污泥样品的来源是完全厌氧农场发酵池。

反应器的设置和运行：反应器在30℃下用合成废水（补充化学元素）运行85天，初始工作体积为0.8L，水力停留时间（HRT）为48小时。对照处理在培养基中添加(NH4)2SO4，C:N:P比例设置为100:5:1.5（低C:N）。第二处理不含任何氮源，C:N:P比为100.:0:1.5（高C:N），对进水、混合液和出水样品进行理化指标分析。

采用乙炔还原法和15N2标记同时测定固氮量，提取DNA分析微生物群落组成，主要包括固氮基因nifH和16srRNA的qPCR定量和高通量测序基因。

结果

1 废水处理效率

不同反应器（高、低C:N）的COD去除率没有显着差异。第85天，高C:N反应器COD去除率为73±4.8%（平均值±标准值），低C:N反应器COD去除率为73±4.8%（平均值±标准值） ）。 N反应器的COD去除率为83±12.6%。因此，氮的可用性并不限制有机物的去除。低和高C:N处理的pH值分别为6.29±0.8和6.31±0.78。低C:N处理的平均溶解氧浓度为1.6±2.2mg/L，高C:N处理的平均溶解氧浓度为1.18±2mg/L。

2高、低C:N反应器中的固定氮

在高 C:N 反应器中，运行 85 天后，总氮（主要以有机形式）从每升不到 10 毫克增加到 280 ± 57 毫克（图 1）。总体而言，在高 C:N 反应器中，有机氮（生物质）的平均日产量为 1.6 ± 0.5 mg/L。在低C:N反应器中，同期后的总氮为175±57 mg N/L，其中约一半（80±14 mg N/L）为铵态氮（图1）。两种处理的硝酸盐（每升低于 6 毫克氮）和亚硝酸盐（每升低于 0.6 毫克氮）含量都非常低。

图1 低C:N（对照）和高C:N处理运行85天后进水、混合液和出水中亚硝酸盐、硝酸盐、铵态氮和有机氮含量。

3 高、低C:N反应器中的固氮

使用15N2标记或乙炔还原，低C:N反应器中的固氮率为零。在培养第 51 小时，高 C:N 反应器以每毫升每小时 12 至 20 纳摩尔 N（每天最多 11.8 毫克氮）的速率固定氮（图 2）。乙炔还原实验给出了类似的结果。 ，每毫升含有 13 至 25 纳摩尔 C2H4。乙炔还原率与固氮率之比称为R比。在固氮反应器中，其范围为1.2～1.5。

图 2. 在反应器中孵育 0、24 和 51 小时后，低 C:N（对照）、高 C:N 和阳性对照 A. vinelandii 处理的 15N2 固定率。

图 4 高和低 C:N 反应器中 nifH 和 16S rRNA 基因的丰度

不同处理的反应器中16S rRNA基因的数量随着培养时间的增加而增加（图3a）；基因拷贝数作为生物量定量的指标，分别在高C:N和低C:N处理中发现。增加 25 倍和 19 倍（相对于第 0 天），低 C:N 处理比高 C:N 处理具有更少的 16S rRNA 基因 (29%)，实验反应器和对照反应器之间的挥发性悬浮固体 (VSS) 无差异。每微升接种物含有 3.9±0.2 106 个 nifH 拷贝（图 3b）。假设每个细胞含有4.2个拷贝的16S rRNA和1个拷贝的nifH，则可以计算出反应器中自生固氮细菌NFB的数量；它约占固氮反应器中生物量的15%，但在低C:N时从16%下降到1.5%（图3c）。

图 3. a 的相对丰度变化。 16S rRNA 基因 B. nifH 基因 C．高和低 C:N 反应器中的自生固氮细菌 NFB。

5 微生物群落分析

16S rRNA基因序列聚类分析，第0天的接种物和所有样品形成单个簇，来自两个处理（低C:N和高C:N）的样品形成另外两个不同的簇（图4）。第0天采集的样品微生物群落结构高度相似（约80%），运行85天后所有反应器中微生物群落的多样性几乎无法区分。

图 4. 接种样品中微生物群落的比较（Bray-Curtis 相似度）

即使在门级评估，低C:N反应器和固氮反应器在运行85天后也形成了完全不同的群落（图5a）。高C:N反应器中最丰富的三个门是Chloroflexi (26±7%)、Proteobacteria (24±6%)和Firmicutes (22±6%)。在低C:N反应器中，拟杆菌门（35±0.3%）、放线菌门（31±4%）和变形菌门（21±1%）最丰富。高C:N反应器中最丰富的巴氏梭菌（19±5.4%）属于厚壁菌门。在低C:N反应器中，最丰富的微生物是棒状杆菌，占27±2%（图5b）。它是放线菌门的一种兼性厌氧细菌，常见于污水中。该属包含固氮细菌和异养硝化细菌。

图 5. 细菌群落组成门级 B.属级

对扩增序列进行Dada2去噪，6个ASV（来自nifH功能序列）的物种注释结果来自巴氏巴氏杆菌。 16S rRNA基因和nifH功能基因测序结果均表明为一新菌株。梭菌出现在高 C:N 反应器中。将未分类的nifH-ASV-2与同源nifH序列进行比对，并在系统发育邻接树中进行比较（图6），结果表明该序列与Clostridium sp.、C. Pasteurianum和ASV-12密切相关。同源性高，序列相似度接近66%。与NCBI核酸数据库比对结果表明，该序列与从稻田土壤中稻株残留物中分离得到的丙酸青杆菌一致。 WB4序列相似性为83%。 nifH功能基因可在基因组中以多个拷贝存在，且序列变异程度较高，据报道巴斯德氏菌有6个不同的非同一拷贝，核苷酸序列同源性在68-99%之间。事实上，尽管 ASV-12 与巴氏梭菌 X07474 参考序列聚类，但它仅具有 90% 的核苷酸序列同源性。

图 6. 来自高 C:N 反应器的 nifH-ASV（以灰色突出显示）的系统发育树及其最近识别的参考序列。 Bootstrap值为1000，比例尺表示序列分歧距离。

讨论

在不添加任何外部氮源的情况下运行的反应器可以产生富含自生固氮细菌的生物质，并按照与添加氮反应器相同的标准处理废水，并且确信氮来自空气而不是来自回收的生物质，因为几乎没有反应器废水中发现铵或氮氧化物。自生固氮细菌已被证明可以增加谷物和甘蔗等植物的氮吸收，因此此类污泥可以用作生物肥料。此外，一些自生固氮细菌可以在某些非豆科植物中定殖并形成共生关系，促进植物生长和产量。废水处理污泥的元素组成可以作为后续研究的主题，以评估其作为生物肥料的适用性。

与传统的减氮废水处理系统相比，废水中微生物固氮的策略具有可持续性，且运行成本更低；它不需要添加额外的氨，并且在低溶解氧浓度（低于 0.5 mgO2/L）下运行。通常较低的溶解氧浓度被认为有利于自生固氮细菌的生长，并显着降低运营成本（占活性污泥厂耗电量的70%以上）。水力停留时间和污泥停留时间对自生固氮细菌选择的影响尚未阐明，应进一步研究以优化其繁殖。作者通过实验观察到，固氮速率（11.8 mg N/L/d）与反应器中的理论固氮量（9.9 mg/L/d）相当，并在其他突破性固氮技术中得到报道。例如，在无机生物固氮混合系统中，利用黄杆菌自养纯培养物并通过催化水分解（使用可再生能源）获得氢气，获得了每天455·12 mg N的固氮率。然而，该过程的更高速率需要考虑催化剂的成本和稳定性以及维持纯培养物的难度。

乙炔还原率与固氮率之比称为R比。尽管R比的理论值为3.2，但其范围为1至30。因此，在外推数据以获得生物固氮的估计之前，用15N2方法校准乙炔还原方法非常重要。以前评估废水处理系统固氮的工作仅使用乙炔还原法来估算固氮率。使用nifH基因对细菌进行分类具有挑战性，因为nifH基因可以水平转移，因此其系统发育与16S rRNA基因系统发育不太一致，并且由于其中存在多个不同的nifH拷贝，分类更加复杂。

据估计，全球造纸和纸浆工业每年至少产生 39.01 亿升废水。因此，这些高碳氮废水每年至少可以提供91.38吨氮固定能源。这一数额仅相当于哈伯-博世法的年固定量。然而，这种新的固氮策略可用于高 C:N 情况，例如啤酒厂等其他行业的废水。对于买不起化肥的发展中国家的农民来说，nifH 与假定的细菌总数的比率非常重要。反应器的水平均比 Bowers 等人报道的低 10 倍，这可能受到实验条件（废水成分、水力停留时间、氧气水平驱动的溶解等）的影响，但也可能受到分析方法的影响，例如DNA提取、引物选拔等