降低雪茄烟叶单宁含量的细菌菌株筛选及其对烟叶品质的改善研究

文章作者

张萌萌1、刘谦2、潘勇3、张又奇1、张晓瑞4、梁俊阳1、王欢欢1、张小平1、吴云杰1、付波*1、邹琳*2

1. 河南农业大学烟草学院，郑州市郑东新区平安大道218号 450046

2.南宁市西乡塘区北湖南路28号广西中烟工业有限责任公司技术中心 530001

3.湖北中烟工业有限责任公司三峡卷烟厂，湖北省宜昌市夷陵区黄黄路46号 443100

4.四川中烟工业有限责任公司成都卷烟厂，成都市锦江区成龙大道一段56号 610011

文章摘要

为了降低雪茄烟叶中单宁含量（质量分数），降低雪茄烟叶苦味，提高烟叶品质，从雪茄烟叶表面筛选出16株对烟叶中单宁具有降解作用的菌株，并进行了筛选。通过测量单宁酶活性来选择。产酶能力最强的菌株B-3被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans)。

选择不同类型的碳源、氮源和无机盐，设置不同的质量浓度梯度，筛选菌株B-3的最佳产酶培养基（蔗糖15.45 g/L，酵母抽提物17.00 g/L，NaCl 4.94 g/ L）。产酶培养基优化后，菌株B-3产生的酶液单宁酶活力高达55.83 U/mL，比产酶基础培养基提高了121.28%。将酶液用无菌水稀释成单宁酶活性为5.58 U/mL的稀酶液，用该稀酶液发酵印尼雪茄烟叶。将稀释后的酶液添加至雪茄烟叶质量的25%，在45℃下发酵7天，雪茄烟叶的单宁降解率为39.69%，烟叶的苦味和放气量减少。减少了。

文章背景

雪茄叶具有刺激性高、味道苦的特点。调制发酵可以改善雪茄烟叶的刺激问题，但苦味的改善并不明显。大多数未成熟水果（如柿子、葡萄皮、石榴皮等）的苦味与单宁有关。当单宁含量（质量分数）超过1%时，果实有强烈的苦味。该研究小组此前发现，在苦味较淡的雪茄烟叶表面喷洒单宁溶液，会产生类似印尼雪茄烟叶的苦味。据推测，雪茄叶的苦味可能与单宁有关。

单宁降解主要有浸泡法、热处理法和微生物法。然而，烟草是一种特殊的食物。浸水方法和热处理方法会对烟叶品质产生较大影响。微生物法更适合烟叶中单宁的降解。利用微生物和酶降解烟叶中大分子物质的相关研究已有报道。然而，利用微生物降解雪茄叶单宁的报道却很少。

为此，以印尼雪茄烟叶为材料，通过平板包被法从雪茄烟叶表面分离出单宁酶活性最高的菌株，筛选单宁酶活性最高的菌株及其产酶培养基优化制备雪茄烟叶发酵酶液。在此基础上利用酶液对雪茄烟叶发酵工艺进行优化，旨在为利用微生物降解雪茄烟叶单宁、提高雪茄品质提供基础。

文章概述

测试的烟叶是2013年生产的印度尼西亚雪茄烟叶（品种：BESUKI）。常规化学成分含量见表1。

表1 供试烟叶常规化学成分含量

表1 供试雪茄烟叶常规化学成分含量

使用响应面法对 Box-Behnken Design 方法进行了分析。分别以最佳碳源（A）、氮源（B）和无机盐（C）作为自变量。每个因素设置为3个水平。以菌株B-3的单宁酶活性Y为响应值进行响应面优化，计算出最适宜的产酶培养基，并进行实验验证。采用Design Expert 11软件进行响应面实验设计与分析。响应面实验因子及水平设计如表2所示。

表 2 Box-Behnken 设计因素和水平

表 2 Box-Behnken 设计的因素及其水平

(g·L-1)

在单因素实验结果的基础上，以发酵时间、酶液单宁酶活性、发酵温度为自变量，设计三因素三水平正交实验测定雪茄烟叶中单宁含量。每个处理重复三次以优化雪茄。烟叶发酵过程。正交实验设计如表3所示。

表3 正交实验设计

表 3 正交实验设计

雪茄烟叶采用半叶法发酵（将烟叶沿主脉分成两部分，一部分用于对照处理，另一部分用酶溶液处理）。发酵完成后，将雪茄卷成雪茄，并在22℃、相对湿度60%的条件下储存。在 48 小时的条件下平衡水分。河南农业大学烟草学院的五位雪茄评价专家在平衡水分含量后，对雪茄的风格和品质特征进行了感官评价。风格质量指标及评分标准见表4、表5。

表4 雪茄烟叶风格特征评分标准

表4 雪茄烟叶感官风格特征评分标准

表5 雪茄烟叶品质特征评分标准

表5 雪茄烟叶品质特性评分标准

如图1所示，D/d>1.5的菌株有5个，分别为菌株DT-1、B-3、DT-3、YCYM-04和YCYM-09，其中菌株B-3的D/d最大。 d. （表 6）。

图1 鞣酸酶产生菌株的颜色变化圈及生长状况

图1 鞣酸酶产生菌株的变色圈和生长情况

表6 5种单宁降解菌变色圈直径和菌落直径①

表6 5种单宁降解菌的变色圈直径和菌落直径

注：①同一列数据中不同小写字母表示不同菌株间差异显着（P

菌株DT-1、B-3、DT-3、YCYM-04和YCYM-09的酶活性分别为16.74、25.23、7.58、10.07和13.09 U/mL（图2）。其中，菌株B-3的鞣酸酶活性最高，为25.23 U/mL，比菌株DT-1（16.74 U/mL）高50.72%。

图中不同小写字母表示在5%水平上差异显着。下同。

图2 5株单宁降解菌单宁酶活性

图2 5种单宁降解菌的单宁酶活性

从图3可以看出，菌株B-3的菌落呈黄色、不透明、边缘不规则。细菌细胞呈杆状，尺寸为1.62μm×0.48μm，表面凹凸不平。从表7可以看出，菌株B-3可以利用葡萄糖、麦芽糖和硝酸盐，并且可以产生接触酶和苯丙氨酸脱氨酶。

图3 B-3菌落形态特征

表7 菌株B-3生理生化特征①

表7 菌株B-3的生理生化特性

注：①表中“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

将菌株B-3的16S rDNA序列与NCBI数据库进行比对，发现菌株B-3与Pantoea sp.有相似性。为 99%；根据菌株B-3的系统发育树（图4）以及菌株B-3的形态特征、生理生化特征，将菌株B-3鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans）。

图4 菌株B-3的系统发育树

从图5可以看出，与果糖和葡萄糖相比，当蔗糖为产酶培养基碳源时，鞣酸酶活性最高（47.51 U/mL）；与其他氮源相比，当NaNO3为氮源时，鞣酸酶活性最低（22.64 U/mL）。当酵母抽提物为产酶培养基氮源时，鞣酸酶活性最高（50.97 U/mL）；与其他无机盐相比，当产酶培养基无机盐为 NaCl 时，菌株 B-3 的鞣酸酶活力最高（54.03 U/mL），比 MgSO4、CaCl2 和 K2HPO4 高 13.33、31.11 和 13.11分别。 17.50 U/mL，表明该菌株对Na+的利用效果高于Mg2+、Ca2+和K+。

图5 不同因素对菌株B-3鞣酸酶活性的影响

从图6可以看出，5个蔗糖质量浓度梯度中，当产酶培养基蔗糖质量浓度为15 g/L时，鞣酸酶活力最高，为49.48 U/mL；当酵母抽提物质量浓度为20 g/L时，与其他酵母抽提物相比，鞣酸酶活性质量浓度最高，为52.36 U/mL。鞣酸酶活力较产酶基础培养基提高107.53%。 5个NaCl质量浓度梯度中，当NaCl质量浓度为5 g/L时，鞣酸酶活力最高（55.14 U/mL），鞣酸酶活力比产酶基础培养基高118.54%。

图6 各因子浓度对鞣酸酶活性的影响

Box-Behnken Design 设计了 17 种测试组合。测试结果如表8所示。通过Design-Expert 11软件计算各因素对该菌株鞣酸酶活性（Y）的多元回归模型为：Y=55.69+1.36A+2.22 B－0.31C－0.48AB +1.25AC+0.067BC－6.25A2－2.71B2－2.78C2。

表8 响应面实验设计及结果

表 8 响应面试验设计及结果

从表9可以看出，回归模型的精度满足检验的预期要求（PP>0.05），决定系数R2=0.9310。 A2 与菌株 B-3 的鞣酸酶活性呈极显着相关（PA、B、B2、C2 与菌株 B-3 的鞣酸酶活性显着相关（P

表9 回归模型的方差分析①

表 9 回归模型方差分析

注：①*表示差异显着（PP

由图7可以看出，菌株B-3的鞣酸酶活性与蔗糖、酵母抽提物和NaCl的质量浓度呈正相关，且蔗糖质量浓度对菌株B-3的鞣酸酶活性影响更为显着。。蔗糖与酵母抽提物之间的相互作用最强，其次是蔗糖与NaCl之间，酵母抽提物与NaCl之间的相互作用最弱。

图7 各因素交互作用对鞣酸酶活性的影响

从图8可以看出，发酵后0～3天，雪茄烟叶的单宁含量（质量分数）缓慢下降。当发酵9天时，雪茄烟叶的单宁含量由发酵前的15.52mg/g下降到11.12mg/g，下降了28.35%，且发酵后单宁含量趋于稳定（11.12~11.28mg/g）。 9至15天。

一个。酶活力8.37 U/mL、发酵温度45 ℃条件下发酵时间对烟叶单宁含量的影响b．发酵时间9 d、发酵温度45 ℃ c条件下酶活性对烟叶单宁含量的影响。发酵时间9 d、酶活力5.58 U/mL条件下发酵温度对烟叶单宁含量的影响。

图8 发酵条件对烟叶单宁含量的影响

从正交试验结果(表10)可以看出，对雪茄烟叶单宁含量影响最大的是发酵时间，其次是酶液单宁酶活性和发酵温度。根据k值确定雪茄烟叶最佳发酵组合为E1F1G2，即发酵时间为7 d，酶液单宁酶活力为5.58 U/mL，发酵温度为45 ℃。发酵后雪茄烟叶单宁含量为9.36 mg/g，与发酵前（15.52 mg/g）相比，单宁降解率达到39.69%。

表10 正交试验结果

表 10 正交试验结果

采用最佳发酵工艺对雪茄烟叶进行发酵，比较发酵前后雪茄烟叶风格和品质特性的变化（表11、表12）。结果发现，经过酶液发酵后，雪茄烟叶的苦味和杂味减少，空气感改善，香气得到改善。气质变好了。

表11 雪茄烟叶风格特征评价

（观点）

表12 雪茄烟叶品质特性评价

（观点）

该研究得到广西中烟工业有限责任公司科技项目“提高烟叶品质的微生物胞外酶制剂的研究与开发”（GXZYCX2022C006）的资助。

引用这篇文章

张萌萌，刘谦，潘勇，等。雪茄烟叶单宁降解菌的筛选、鉴定及发酵工艺优化[J].烟草科技, 2023, 56(7): 32-40.

张萌萌，刘谦，潘勇，等。优化雪茄烟丝发酵的单宁降解菌筛选与鉴定［J］.烟草科技, 2023, 56(7): 32-40.

DOI：10. 16135/j。 ISSN1002-0861.2023.0091

本文摘自《烟草科技》2023年第7期文章《雪茄烟叶单宁降解菌的筛选、鉴定及发酵工艺优化》。

原文链接：

编辑|褚美洁

回顾|周亚宁

最终审判|胡斌